陽離子脂質材料DOTMA、DOPE脂質體轉染實驗步驟
更新時間:2021-05-25 點擊次數:916次
脂質體(LR)試劑是陽離子脂質體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中,是目前條件下最方面的轉染方法之轉染率高,優于磷酸鈣法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時,首先需要優化轉染條件,應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等,對每批LR都要做,先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間,DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者最佳的劑量,確定出轉染時間,因LR對細胞有一定的毒性,轉染時間以不超過24h為宜。
細胞種類:C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。
一、操作步驟:
取6孔培養板,向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細胞的培養基,37℃、18%C02培養基40%-60%匯合時。
2)轉染液制備:在聚苯yi烯管中制備以下兩液(為轉染1個空細胞所用的A液:用不含血清培養基稀釋DNA使濃度為1-10ug,終量100u1。B液:用不含血清培養基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液,室溫中置10-15min,稍后會岀現微濁現象,但并不妨礙轉染
3)轉染準備:用2m1不含血清培養基漂洗2次,再加入1m1不含血清培養基
4)轉染:把AB復合物緩緩加入培養基中,搖勻,置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉染液,換入正常培養基繼續培養
5)其余處理:如觀察、篩選、檢測等與其他轉染法相同
6)注意:轉染時切勿加血清,血清對轉染效率有很大影響。
二、脂質體快速轉染法的操作步驟
1)將5 105個細胞/孔接種到6孔板中培養24h,使細胞達到50%-60%的板底面積。
2)在試管中制備DNA-脂質體復合物
1.1)在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-新質粒DNA或供體DNA
1.2)旋轉1s,然后加入脂質體混懸液,旋轉。
1.3)室溫放置5-10分鐘,使DNA與脂質體結合。
3.棄去細胞內的舊液,用1m1無血清DMEM洗滌細胞一次,然后棄去細胞,直接向每個孔中加入1 m1脫氧核糖核酸-脂質體復合物,在37培養3-5天,然后向每個孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續培養14-24小時。吸出脫氧核糖核酸脂質體混合物,加入含10%胎牛血清的新鮮DMEM,2m1/l,培養24-48h。通過細胞刮取或消化收集細胞用于分析和鑒定.
三、穩定的脂質體轉染方法:
1)接種的細胞與上述相同,細胞生長到50%
2)DNA-脂質體復合物轉染細胞的制備同上。
3)向每個孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,在37培養48h。
4)吸出DEM,用G418選擇性培養基稀釋細胞,讓細胞生長一定時間,篩選轉染克隆。該方法按照細胞克隆篩選方法進行。